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HPLC Grundlagen und HPLC Infos
Unter dem Begriff Flüssig - Chromatographie werden physikalische Methoden zusammengefasst, bei denen eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) festen Phase und einer sich bewegenden (mobilen) flüssigen Phase erfolgt (z. Bsp. HPLC). Notwendige Voraussetzung ist, dass die zu analysierenden Substanzgemische in einem Lösemittel gelöst vorliegen und dass die Substanzen schwerflüchtig oder nichtflüchtig sind. Für flüchtige Substanzen kommt hauptsächlich die Gas- Chromatographie zum Einsatz.
Unter dem Begriff Flüssig-Flüssig-Chromatographie werden physikalische Methoden zusammengefasst, bei denen eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) flüssigen Phase und einer sich bewegenden (mobilen) flüssigen Phase erfolgt (siehe FCPC).
Die HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ist ein Verfahren der Flüssig-Chromatographie. Sie stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Proben mittels einer flüssigen Phase (Eluent) unter hohem Druck über die stationäre Phase durch eine Trennsäule (feste Phase) transportiert wird.
Je nach Art der Wechselwirkung zwischen stationärer Phase, mobiler Phase und Probe unterscheidet man in der Flüssig-Chromatographie folgende Trennmechanismen: Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch-, Ausschluss- und Affinitäts-Chromatographie.
Bei der HPLC finden hauptsächlich die Verfahren der Adsorptions- und Verteilungs-Chromatographie Anwendung.
Bei der Adsorptions-Chromatographie werden Probenmolekühle durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen reversibel an die stationäre Phase gebunden. Die Verweildauer der Substanzen an der stationären Phase ist aufgrund der unterschiedlich starken Wechselwirkung mit der Oberfläche der stationären Phase unterschiedlich lang. Dadurch werden die Probesubstanzen voneinander getrennt.
In der Normalphasen-Verteilungs-Chromatographie ist die stationäre Phase polarer als die mobile Phase, in der Reversed-Phase-Chromatographie (RP-Umkehrphase) ist die mobile Phase polarer als die stationäre Phase. Die stationäre Phase kann an ein Trägermaterial chemisch gebunden werden oder das Trägermaterial wird einfach mit der stationären Phase belegt. Die Reversed-Phase-Chromatographie wird vorwiegend bei polaren oder unpolaren Substanzen angewendet.
Die SCPC (Speed-Centrifugal-Partition-Chromatography) ist ein Verfahren der Flüssig-Chromatographie. Es stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Probenflüssigkeit mittels einer mobilen Phase (flüssig) unter mittlerem Druck durch die stationäre Phase (flüssig) durch einen Rotor transportiert wird. Sonst wie bei der HPLC.
Unter dem Begriff Flüssig - Chromatographie werden physikalische Methoden zusammengefasst, bei denen eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) festen Phase und einer sich bewegenden (mobilen) flüssigen Phase erfolgt (z. Bsp. HPLC). Notwendige Voraussetzung ist, dass die zu analysierenden Substanzgemische in einem Lösemittel gelöst vorliegen und dass die Substanzen schwerflüchtig oder nichtflüchtig sind. Für flüchtige Substanzen kommt hauptsächlich die Gas- Chromatographie zum Einsatz.
Unter dem Begriff Flüssig-Flüssig-Chromatographie werden physikalische Methoden zusammengefasst, bei denen eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) flüssigen Phase und einer sich bewegenden (mobilen) flüssigen Phase erfolgt (siehe FCPC).
Die HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ist ein Verfahren der Flüssig-Chromatographie. Sie stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Proben mittels einer flüssigen Phase (Eluent) unter hohem Druck über die stationäre Phase durch eine Trennsäule (feste Phase) transportiert wird.
Je nach Art der Wechselwirkung zwischen stationärer Phase, mobiler Phase und Probe unterscheidet man in der Flüssig-Chromatographie folgende Trennmechanismen: Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch-, Ausschluss- und Affinitäts-Chromatographie.
Bei der HPLC finden hauptsächlich die Verfahren der Adsorptions- und Verteilungs-Chromatographie Anwendung.
Bei der Adsorptions-Chromatographie werden Probenmolekühle durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen reversibel an die stationäre Phase gebunden. Die Verweildauer der Substanzen an der stationären Phase ist aufgrund der unterschiedlich starken Wechselwirkung mit der Oberfläche der stationären Phase unterschiedlich lang. Dadurch werden die Probesubstanzen voneinander getrennt.
In der Normalphasen-Verteilungs-Chromatographie ist die stationäre Phase polarer als die mobile Phase, in der Reversed-Phase-Chromatographie (RP-Umkehrphase) ist die mobile Phase polarer als die stationäre Phase. Die stationäre Phase kann an ein Trägermaterial chemisch gebunden werden oder das Trägermaterial wird einfach mit der stationären Phase belegt. Die Reversed-Phase-Chromatographie wird vorwiegend bei polaren oder unpolaren Substanzen angewendet.
Die SCPC (Speed-Centrifugal-Partition-Chromatography) ist ein Verfahren der Flüssig-Chromatographie. Es stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Probenflüssigkeit mittels einer mobilen Phase (flüssig) unter mittlerem Druck durch die stationäre Phase (flüssig) durch einen Rotor transportiert wird. Sonst wie bei der HPLC.
Anlagentypen
Es wird hauptsächlich zwischen isokratisch und gradient unterschieden.
Bei einer isokratischen HPLC wird während eines Laufes nur mit einer Zusammensetzung des Eluenten gearbeitet. Das heißt die Wechselwirkung zwischen mobiler und stationärer Phase ist über die gesamte Zeit der Trennung konstant. Man kann damit vor allem ähnliche Substanzen gut trennen. Diese Art der Durchführung ist vor allem in der Routine besonders beliebt und sollte nach Möglichkeit für alle Trennaufgaben angestrebt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass man für diese Arbeitsweise nur eine Pumpe zur Förderung der Eluenten benötigt.
Bei einer Gradienten HPLC wird die Zusammensetzung des Eluenten kontinuierlich über die Zeit geändert. Man erreicht so eine stetige Änderung der Wechselwirkung zwischen Eluent und stationärer Phase. Die Probesubstanzen werden so schneller von den Austauschplätzen an der stationären Phase verdrängt. Man ist damit in der Lage auch Substanzkomponenten sehr unterschiedlicher Polarität noch in akzeptabler Zeit zu trennen. Da bei dieser Arbeitsweise am Anfang einer Trennung eine andere Zusammensetzung des Eluenten vorliegt als am Ende muss man stets darauf achten, dass am Anfang einer Trennung das System im Gleichgewicht ist (=Equilibrierung). Die Mischung des Laufmittels kann gerätetechnisch auf verschiedene Arten durchgeführt werden.
Niederdruckgradient
a) Die Mischung der verschiedenen Eluenten wird durch ein Proportionierventil vor dem Pumpekopf durchgeführt, die Mischung mit der Pumpe durch die Anlage gefördert. Man spricht dann von einem Niederdruckgradienten. Die Mischung geschieht auf der Niederdruckseite (Normaldruck) der Anlage, also vor der Pumpe.
Hochdruckgradient
b) Jeder Eluent wird von einer Pumpe gefördert und die Mischung erfolgt auf der Druckseite der Anlage. Dazu wird eine Mischkammer verwendet. Eine solche Anlage wird als Hochdruckgradienten-HPLC bezeichnet. Bei der Förderung des Eluenten durch die HPLC-Anlage baut sich Druck auf. Den Hauptanteil bewirkt hierbei die Säule. Abhängig vom Trennmaterial, dessen Korngröße und Form, der Säulenlänge und des eingesetzten Eluenten (unterschiedliche Viskosität) ergeben sich Drücke bis ca. 300 bar.
Eine HPLC-Anlage besteht meistens aus fünf Hauptgeräten: Pumpe, Injektionseinheit, Trennsäule, Detektor mit Auswertesoftware und Fraktionensammler. Die HPLC verwendet Trennpartikel mit Korngrößen von 3 bis 10 ìm, sie erreicht damit hohe Trennstufenzahlen, erfordert aber gleichzeitig die Überwindung eines relativ hohen Gegendrucks beim Transport der mobilen Phase durch die dünne Trennsäule (2 - 6 mm Durchmesser). Alle Teile müssen möglichst totvolumenfrei miteinander verbunden werden und druckstabil sein (bis ca. 300 bar).
Eine SCPC-Anlage zur Flüssig-Flüssig Extraktion besteht meistens aus fünf Hauptgeräten: Pumpe, Injektionseinheit, Rotor (anstatt der Säule), Detektor mit Auswertesoftware und Fraktionensammler. Der SCPC (Speed-Centrifugal-Partition-Chromatography) verwendet anstatt der Säule mit fester Phase einen Rotor mit Trennkammern (über 1000 Kammern), man erreicht damit hervorragende Trennungen. Alle Teile müssen möglichst totvolumenfrei miteinander verbunden werden und druckstabil sein (bis ca. 150 bar).
Bei der Probenaufgabe wird die Probe zunächst drucklos in eine Probenschleife injiziert, die sich an einem 4-Wege-Ventil befindet. Durch Umschalten wird der Eluentenstrom dann durch die Probenschleife geführt, wodurch die Probe in die Säule gelangt. Die analytische Trennsäule, meist aus Edelstahl, kann beheizbar sein. Zur Detektion werden UV/VIS Detektor, Floureszens Detektor, RI Detektor, Leitfähigkeits Detektor und Chiral Detktor mit Flusszellen verwendet.
Die Auswertung des Ergebnisses der Stofftrennung erfolgt in der Chromatographie-Software und wird in Form eines Chromatogramms dargestellt, einer Elutionskurve. Sie stellt die Abhängigkeit der eluierten Substanzenmengen (Konzentration) von der Zeit dar. Die einzelnen Stoffe haben unterschiedliche Retentionszeiten. Die Bruttoretentionszeit tR setzt sich aus der Nettoretentionszeit t´R (Aufenthalt in der stationären Phase) und der Durchflusszeit der mobilen Phase (ohne Retention) tm zusammen.
t´R = tR - tm
Es wird hauptsächlich zwischen isokratisch und gradient unterschieden.
Bei einer isokratischen HPLC wird während eines Laufes nur mit einer Zusammensetzung des Eluenten gearbeitet. Das heißt die Wechselwirkung zwischen mobiler und stationärer Phase ist über die gesamte Zeit der Trennung konstant. Man kann damit vor allem ähnliche Substanzen gut trennen. Diese Art der Durchführung ist vor allem in der Routine besonders beliebt und sollte nach Möglichkeit für alle Trennaufgaben angestrebt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass man für diese Arbeitsweise nur eine Pumpe zur Förderung der Eluenten benötigt.
Bei einer Gradienten HPLC wird die Zusammensetzung des Eluenten kontinuierlich über die Zeit geändert. Man erreicht so eine stetige Änderung der Wechselwirkung zwischen Eluent und stationärer Phase. Die Probesubstanzen werden so schneller von den Austauschplätzen an der stationären Phase verdrängt. Man ist damit in der Lage auch Substanzkomponenten sehr unterschiedlicher Polarität noch in akzeptabler Zeit zu trennen. Da bei dieser Arbeitsweise am Anfang einer Trennung eine andere Zusammensetzung des Eluenten vorliegt als am Ende muss man stets darauf achten, dass am Anfang einer Trennung das System im Gleichgewicht ist (=Equilibrierung). Die Mischung des Laufmittels kann gerätetechnisch auf verschiedene Arten durchgeführt werden.
Niederdruckgradient
a) Die Mischung der verschiedenen Eluenten wird durch ein Proportionierventil vor dem Pumpekopf durchgeführt, die Mischung mit der Pumpe durch die Anlage gefördert. Man spricht dann von einem Niederdruckgradienten. Die Mischung geschieht auf der Niederdruckseite (Normaldruck) der Anlage, also vor der Pumpe.
Hochdruckgradient
b) Jeder Eluent wird von einer Pumpe gefördert und die Mischung erfolgt auf der Druckseite der Anlage. Dazu wird eine Mischkammer verwendet. Eine solche Anlage wird als Hochdruckgradienten-HPLC bezeichnet. Bei der Förderung des Eluenten durch die HPLC-Anlage baut sich Druck auf. Den Hauptanteil bewirkt hierbei die Säule. Abhängig vom Trennmaterial, dessen Korngröße und Form, der Säulenlänge und des eingesetzten Eluenten (unterschiedliche Viskosität) ergeben sich Drücke bis ca. 300 bar.
Eine HPLC-Anlage besteht meistens aus fünf Hauptgeräten: Pumpe, Injektionseinheit, Trennsäule, Detektor mit Auswertesoftware und Fraktionensammler. Die HPLC verwendet Trennpartikel mit Korngrößen von 3 bis 10 ìm, sie erreicht damit hohe Trennstufenzahlen, erfordert aber gleichzeitig die Überwindung eines relativ hohen Gegendrucks beim Transport der mobilen Phase durch die dünne Trennsäule (2 - 6 mm Durchmesser). Alle Teile müssen möglichst totvolumenfrei miteinander verbunden werden und druckstabil sein (bis ca. 300 bar).
Eine SCPC-Anlage zur Flüssig-Flüssig Extraktion besteht meistens aus fünf Hauptgeräten: Pumpe, Injektionseinheit, Rotor (anstatt der Säule), Detektor mit Auswertesoftware und Fraktionensammler. Der SCPC (Speed-Centrifugal-Partition-Chromatography) verwendet anstatt der Säule mit fester Phase einen Rotor mit Trennkammern (über 1000 Kammern), man erreicht damit hervorragende Trennungen. Alle Teile müssen möglichst totvolumenfrei miteinander verbunden werden und druckstabil sein (bis ca. 150 bar).
Bei der Probenaufgabe wird die Probe zunächst drucklos in eine Probenschleife injiziert, die sich an einem 4-Wege-Ventil befindet. Durch Umschalten wird der Eluentenstrom dann durch die Probenschleife geführt, wodurch die Probe in die Säule gelangt. Die analytische Trennsäule, meist aus Edelstahl, kann beheizbar sein. Zur Detektion werden UV/VIS Detektor, Floureszens Detektor, RI Detektor, Leitfähigkeits Detektor und Chiral Detktor mit Flusszellen verwendet.
Die Auswertung des Ergebnisses der Stofftrennung erfolgt in der Chromatographie-Software und wird in Form eines Chromatogramms dargestellt, einer Elutionskurve. Sie stellt die Abhängigkeit der eluierten Substanzenmengen (Konzentration) von der Zeit dar. Die einzelnen Stoffe haben unterschiedliche Retentionszeiten. Die Bruttoretentionszeit tR setzt sich aus der Nettoretentionszeit t´R (Aufenthalt in der stationären Phase) und der Durchflusszeit der mobilen Phase (ohne Retention) tm zusammen.
t´R = tR - tm
Beispiel einer SCPC-Anlage
Die HPLC-Pumpe
Sie saugt das Lösungsmittel bzw. Laufmittelgemisch (Eluent) aus einem Vorratsgefäß über das Einlassventil in den Pumpenkopf. Der Kolben des Pumpenkopfs komprimiert den Eluenten und drückt ihn durch das Auslassventil und über das Injektionsventil durch die Säule/den Rotor. Von dort gelangt die Substanz durch die Flusszelle im Detektor zum Fraktionensammler. Eine Pumpe enthält oft zwei Kolben (Doppelkolbenpumpe). Während der eine das Laufmittel ansaugt, drückt der zweite Kolben das zuvor angesaugte Laufmittel durch das Auslassventil in die HPLC/FCPC-Anlage. Dieser Vorgang wird mittels modernster Mechanik und Elektronik exakt gesteuert, sodass ein konstanter Fluss möglichst ohne Druckstöße (Pulsation) erfolgen kann. Manche Pumpen haben zusätzlich einen Pulsationsdämpfer zur Beseitigung von Druckstößen. Einen Druckaufnehmer damit am Pumpenkopfausgang der entstehende Druck gemessen und im Pumpendisplay angezeigt werden kann, ein Abschalten der Pumpe bei Überschreitung eines eingestellten Limits ist somit möglich. Der Betriebsdruck sollte gelegentlich überprüft werden, da durch ihn indirekt Verstopfungen, Flussschwankungen oder Leckagen erkannt werden können.
Die Probenaufgabe
Die Probe kann entweder manuell, mittels Injektionsventil, oder automatisch, mittels Autosampler, in die HPLC/FCPC-Anlage eingebracht werden. Die Probe muss unter Umgebungsdruck in die unter Druck stehende Leitung der Anlage injiziert werden. Das erfolgt manuell meist über ein Mehrwegeventil, hierbei wird mit einer Spritze eine definierte Menge in eine am Ventil montierte Probenschleife (drucklos) eingespritzt. Durch umlegen des Ventilhebels, zur Druckseite, wird der Eluentenstrom durch die Probenschleife geleitet und spült so die Probe auf die Säule.
Bei der automatischen Probenaufgabe wird die Probe aus Gefäßen entnommen, die sich in einem elektronisch gesteuertem Gerät befinden, dem Autosampler. Über ein elektrisch betätigtes Ventile gelangt die Probe dann ebenfalls auf die Säule.
Verschiedene Autosampler bieten die Möglichkeit zur Probenvorbereitung. Dazu gehören das automatisierte Verdünnen und Mischen der Probe und die Vorsäulenderivatisierung. Mit der geeigneten HPLC-Software verdünnen die Geräte hoch konzentrierte Proben automatisch, sodass nach nur wenigen Injektionen die höchste Analysengenauigkeit erreicht und eine Überladung der Säule verhindert wird. Liegt die Konzentration außerhalb des kalibrierten Bereiches, werden diese Over-Range-Proben ebenfalls verdünnt, sodass ein erneutes Analysieren entfällt. Um die Analysenzeiten zu verkürzen, arbeiten einige Geräte mit der Sample-Overlap-Funktion. Während eine Probe noch aufgetrennt wird, erfolgt bei der nächsten schon die Vorbereitung. Das Mischen mit einem internen Standard, die Zugabe von Reagenzien oder das Herstellen von Standardlösungen und Kalibrierungen sind weitere Funktionen einiger Autosampler.
Sie saugt das Lösungsmittel bzw. Laufmittelgemisch (Eluent) aus einem Vorratsgefäß über das Einlassventil in den Pumpenkopf. Der Kolben des Pumpenkopfs komprimiert den Eluenten und drückt ihn durch das Auslassventil und über das Injektionsventil durch die Säule/den Rotor. Von dort gelangt die Substanz durch die Flusszelle im Detektor zum Fraktionensammler. Eine Pumpe enthält oft zwei Kolben (Doppelkolbenpumpe). Während der eine das Laufmittel ansaugt, drückt der zweite Kolben das zuvor angesaugte Laufmittel durch das Auslassventil in die HPLC/FCPC-Anlage. Dieser Vorgang wird mittels modernster Mechanik und Elektronik exakt gesteuert, sodass ein konstanter Fluss möglichst ohne Druckstöße (Pulsation) erfolgen kann. Manche Pumpen haben zusätzlich einen Pulsationsdämpfer zur Beseitigung von Druckstößen. Einen Druckaufnehmer damit am Pumpenkopfausgang der entstehende Druck gemessen und im Pumpendisplay angezeigt werden kann, ein Abschalten der Pumpe bei Überschreitung eines eingestellten Limits ist somit möglich. Der Betriebsdruck sollte gelegentlich überprüft werden, da durch ihn indirekt Verstopfungen, Flussschwankungen oder Leckagen erkannt werden können.
Die Probenaufgabe
Die Probe kann entweder manuell, mittels Injektionsventil, oder automatisch, mittels Autosampler, in die HPLC/FCPC-Anlage eingebracht werden. Die Probe muss unter Umgebungsdruck in die unter Druck stehende Leitung der Anlage injiziert werden. Das erfolgt manuell meist über ein Mehrwegeventil, hierbei wird mit einer Spritze eine definierte Menge in eine am Ventil montierte Probenschleife (drucklos) eingespritzt. Durch umlegen des Ventilhebels, zur Druckseite, wird der Eluentenstrom durch die Probenschleife geleitet und spült so die Probe auf die Säule.
Bei der automatischen Probenaufgabe wird die Probe aus Gefäßen entnommen, die sich in einem elektronisch gesteuertem Gerät befinden, dem Autosampler. Über ein elektrisch betätigtes Ventile gelangt die Probe dann ebenfalls auf die Säule.
Verschiedene Autosampler bieten die Möglichkeit zur Probenvorbereitung. Dazu gehören das automatisierte Verdünnen und Mischen der Probe und die Vorsäulenderivatisierung. Mit der geeigneten HPLC-Software verdünnen die Geräte hoch konzentrierte Proben automatisch, sodass nach nur wenigen Injektionen die höchste Analysengenauigkeit erreicht und eine Überladung der Säule verhindert wird. Liegt die Konzentration außerhalb des kalibrierten Bereiches, werden diese Over-Range-Proben ebenfalls verdünnt, sodass ein erneutes Analysieren entfällt. Um die Analysenzeiten zu verkürzen, arbeiten einige Geräte mit der Sample-Overlap-Funktion. Während eine Probe noch aufgetrennt wird, erfolgt bei der nächsten schon die Vorbereitung. Das Mischen mit einem internen Standard, die Zugabe von Reagenzien oder das Herstellen von Standardlösungen und Kalibrierungen sind weitere Funktionen einiger Autosampler.
Beispiel einer HPLC-Anlage
Beispiel typischer Autosampler
Die Säulen
Die festen Säulen sind mit den unterschiedlichsten Trennmaterialien (stationären Phase) gefüllt. Das Trennmaterial wird nach dem zu bearbeitenden Trennproblem ausgewählt. Meistens wird eine „C18-Säule verwendet. Die stationäre Phase ist in diesem Fall ein chemisch modifiziertes Kieselgel, auf dessen Oberfläche C18-Ketten aufgebaut sind. Um eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten sollte die Trennsäule bei einer konstanten Temperatur betrieben werden.
Analytische Säulen haben meist einen Innendurchmessern (ID) von 2 - 4.6 mm und eine Länge von 250 mm, sie sind für einen max. Fluss von ca. 2 ml/min geeignet.
Semipräparative Säulen mit einem Innendurchmessern (ID) von 10 - 50 mm und eine Länge von 250 mm, sie sind für einen max. Fluss von ca. 100 ml/min geeignet.
Präparative Säulen mit einem Innendurchmesser (ID) ab 75 mm, sie werden mit einem Fluss ab ca. 100 ml/min verwendet.
Vorsäulen werden direkt vor die Trennsäule geschaltet um deren Verschmutzung zu verhindern. Die Vorsäule hat fast immer das gleiche Trennmaterial wie die Trennsäule.
Die festen Säulen sind mit den unterschiedlichsten Trennmaterialien (stationären Phase) gefüllt. Das Trennmaterial wird nach dem zu bearbeitenden Trennproblem ausgewählt. Meistens wird eine „C18-Säule verwendet. Die stationäre Phase ist in diesem Fall ein chemisch modifiziertes Kieselgel, auf dessen Oberfläche C18-Ketten aufgebaut sind. Um eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten sollte die Trennsäule bei einer konstanten Temperatur betrieben werden.
Analytische Säulen haben meist einen Innendurchmessern (ID) von 2 - 4.6 mm und eine Länge von 250 mm, sie sind für einen max. Fluss von ca. 2 ml/min geeignet.
Semipräparative Säulen mit einem Innendurchmessern (ID) von 10 - 50 mm und eine Länge von 250 mm, sie sind für einen max. Fluss von ca. 100 ml/min geeignet.
Präparative Säulen mit einem Innendurchmesser (ID) ab 75 mm, sie werden mit einem Fluss ab ca. 100 ml/min verwendet.
Vorsäulen werden direkt vor die Trennsäule geschaltet um deren Verschmutzung zu verhindern. Die Vorsäule hat fast immer das gleiche Trennmaterial wie die Trennsäule.
Beispiel Fertigsäulen
Der Säulenpacker
Möchte man bei der Trennsäule mit dem Trennmaterial flexibel sein, so verwendet man einen Säulenpacker oder auch Säulenpackstand.
Dank statischer bzw. dynamisch-axialer Kompression können alle gängigen Trennmaterialien in der von Ihnen gewünschten Bettlänge reproduzierbar gepackt werden.
Auf Grund des einfachen Packvorganges lässt sich die Säule schnell an die Bedürfnisse anpassen und es kann so auf eine Auswahl teurer Fertigsäulen verzichtet werden.
Durch eine verschweißte Fritte im beweglichen Kolben kann das Trägermaterial mit hohen Drücken gepackt werden. Gleichzeitig ist eine gleichmäßige Verteilung der Substanz über den ganzen Säulenquerschnitt und damit eine optimale Peakform gewährleistet.
Des Weiteren lassen sich mit einem Säulenpacker unterschiedlichste Bettlängen mit einem Säulenrohr realisieren. Als Option ist mittels Thermomantel eine Thermostatisierung über die volle Bettlänge möglich.
Die Kompression der Packung kann auf zwei Arten erreicht werden. Entweder mit einer Platz sparenden Handhydraulik oder mit einer pneumatisch angetriebenen Hydraulik für statische und dynamisch axiale Kompression. Bei der statischen Kompression kann die Säule dem Packstand entnommen werden.
Somit können mehrere Säulen mit einem Packstand hergestellt werden. Im Fall der dynamisch axialen Kompression verbleibt die Säule im Packstand.
Bei nachlassender Trennleistung durch entstehendes Totvolumen reicht ein Nachpressen aus, um wieder beste Ergebnisse zu erzielen, während der Säulenpackstand mit der dynamisch-axialen Kompression dies kontinuierlich durchführt.
Möchte man bei der Trennsäule mit dem Trennmaterial flexibel sein, so verwendet man einen Säulenpacker oder auch Säulenpackstand.
Dank statischer bzw. dynamisch-axialer Kompression können alle gängigen Trennmaterialien in der von Ihnen gewünschten Bettlänge reproduzierbar gepackt werden.
Auf Grund des einfachen Packvorganges lässt sich die Säule schnell an die Bedürfnisse anpassen und es kann so auf eine Auswahl teurer Fertigsäulen verzichtet werden.
Durch eine verschweißte Fritte im beweglichen Kolben kann das Trägermaterial mit hohen Drücken gepackt werden. Gleichzeitig ist eine gleichmäßige Verteilung der Substanz über den ganzen Säulenquerschnitt und damit eine optimale Peakform gewährleistet.
Des Weiteren lassen sich mit einem Säulenpacker unterschiedlichste Bettlängen mit einem Säulenrohr realisieren. Als Option ist mittels Thermomantel eine Thermostatisierung über die volle Bettlänge möglich.
Die Kompression der Packung kann auf zwei Arten erreicht werden. Entweder mit einer Platz sparenden Handhydraulik oder mit einer pneumatisch angetriebenen Hydraulik für statische und dynamisch axiale Kompression. Bei der statischen Kompression kann die Säule dem Packstand entnommen werden.
Somit können mehrere Säulen mit einem Packstand hergestellt werden. Im Fall der dynamisch axialen Kompression verbleibt die Säule im Packstand.
Bei nachlassender Trennleistung durch entstehendes Totvolumen reicht ein Nachpressen aus, um wieder beste Ergebnisse zu erzielen, während der Säulenpackstand mit der dynamisch-axialen Kompression dies kontinuierlich durchführt.
Einzelkopf
Doppelkopf
Der Packvorgang:
Das Füllrohr und ein Kolben werden am Säulenrohr montiert und das Slurry wird eingefüllt.
Das Lösemittel des Slurries wird mit einer Vakuumpumpe abgesaugt.
Das Slurry setzt sich ab.
Der obere Kolben mit Deckel wird montiert.
Das Slurry (Säulenmaterial) wird hydraulisch verpresst, der Kolben wird fixiert (statische Kompression) oder kontinuierlich verpresst (dynamisch axiale Kompression).
Das Füllrohr und ein Kolben werden am Säulenrohr montiert und das Slurry wird eingefüllt.
Das Lösemittel des Slurries wird mit einer Vakuumpumpe abgesaugt.
Das Slurry setzt sich ab.
Der obere Kolben mit Deckel wird montiert.
Das Slurry (Säulenmaterial) wird hydraulisch verpresst, der Kolben wird fixiert (statische Kompression) oder kontinuierlich verpresst (dynamisch axiale Kompression).
Verteilungschromatographie "Die rotierende Säule"
Der Speed-Centrifugal-Partition-Chromatograph (SCPC) ist das optimale Gerät für Industrie und Forschung der Bereiche Pharmakognosie, Pharmazeutische Biologie, Organische Chemie, Peptidchemie, Fermentationen, Bodenökologie, etc.
Die SCPC, zur Flüssig-Flüssig Verteilungschromatographie, mit ihrer säulenmaterialfreien Technologie gehört zum Produktbereich der Säulenchromatographie. Die Inhaltsstoffe einer Probe werden hier in einem Rotor (rotierende Säule), in über 1000, in Serie verbundenen Kammern aufgetrennt und nach deren Durchlaufen fraktioniert.
Der Trennprozess findet dabei in zwei, nicht miteinander mischbaren flüssigen Phasen statt, wobei sich die Inhaltsstoffe der Probe gemäß ihrer Polarität in diesen beiden flüssigen Phasen verteilen. Diese so genannte Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie (Extraktion) ermöglicht Auftrennungen von Proben verschiedenster Art im analytischen, präparativen, sowie Produktionsmaßstab. Dabei sind die Anlagen unabhängig von Größe und Durchsatz schematisch immer gleich aufgebaut. Das Herzstück jedes Systems ist die SCPC. Sie stellt quasi die Trennsäule dar, umgeben von Peripheriegeräten, wie HPLC-Pumpe, dem Aufgabesystem für Proben, dem UV-VIS-Detektor, einem Fraktionssammler und dem Computer mit HPLC- Software zur Steuerung der Anlage und Auswertung der Chromatogramme.
Vergleichend mit der HPLC-Chromatographie ist die SCPC-Technologie problemloser, einfacher und kostengünstiger, vor allem wenn Rohextrakte verschiedenster Matrices aufgereinigt werden müssen. Dabei steht er nicht direkt in Konkurrenz zur HPLC, sondern beschleunigt in Kombination mit dieser den gesamten chromatographischen Prozess bis hin zum reinen Produkt.
Der Speed-Centrifugal-Partition-Chromatograph (SCPC) ist das optimale Gerät für Industrie und Forschung der Bereiche Pharmakognosie, Pharmazeutische Biologie, Organische Chemie, Peptidchemie, Fermentationen, Bodenökologie, etc.
Die SCPC, zur Flüssig-Flüssig Verteilungschromatographie, mit ihrer säulenmaterialfreien Technologie gehört zum Produktbereich der Säulenchromatographie. Die Inhaltsstoffe einer Probe werden hier in einem Rotor (rotierende Säule), in über 1000, in Serie verbundenen Kammern aufgetrennt und nach deren Durchlaufen fraktioniert.
Der Trennprozess findet dabei in zwei, nicht miteinander mischbaren flüssigen Phasen statt, wobei sich die Inhaltsstoffe der Probe gemäß ihrer Polarität in diesen beiden flüssigen Phasen verteilen. Diese so genannte Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie (Extraktion) ermöglicht Auftrennungen von Proben verschiedenster Art im analytischen, präparativen, sowie Produktionsmaßstab. Dabei sind die Anlagen unabhängig von Größe und Durchsatz schematisch immer gleich aufgebaut. Das Herzstück jedes Systems ist die SCPC. Sie stellt quasi die Trennsäule dar, umgeben von Peripheriegeräten, wie HPLC-Pumpe, dem Aufgabesystem für Proben, dem UV-VIS-Detektor, einem Fraktionssammler und dem Computer mit HPLC- Software zur Steuerung der Anlage und Auswertung der Chromatogramme.
Vergleichend mit der HPLC-Chromatographie ist die SCPC-Technologie problemloser, einfacher und kostengünstiger, vor allem wenn Rohextrakte verschiedenster Matrices aufgereinigt werden müssen. Dabei steht er nicht direkt in Konkurrenz zur HPLC, sondern beschleunigt in Kombination mit dieser den gesamten chromatographischen Prozess bis hin zum reinen Produkt.
SCPC
Rotor
Die Detektoren
Die Aufgabe eines Detektors besteht darin, die in der Trennsäule getrennten und in der
mobilen Phase stark verdünnten Probnemoleküle zu erkennen.
Der am häufigsten in der HPLC verwendete Detektor ist z.Zt. der UV/Vis-Detektor.
Hierbei wird UV-Licht (Deuterium- oder Quarzlampe) einer bestimmten Wellenlänge durch eine Flusszelle
gestrahlt und dahinter auf einer Photodiode aufgefangen und als elektrisches Signal an die HPLC-Software
ausgegeben. Dabei wird der Lichtstrahl über Spiegel durch die Messzelle und durch die Vergleichmesszelle
gelenkt. Da Eluent und Probe das Licht unterschiedlich absorbieren ergibt ein sich veränderndes elektrisches
Signal. Diese Änderungen werden als Peak in der HPLC-Software angezeigt. Das Chromatogramm setzt sich
aus diesen Peaks zusammen.
Immer stärker kommt der universelle Dioden-Array-Detector (DAD) oder auch Photo-Dioden-Array-Detector (PDA) genannt, zum Einsatz. Er arbeitet ebenfalls im UV/Vis-Bereich (Deuteriumlampe oder Quarzlampe), allerdings wird hier das Analysenlicht als gesamtes Spektrum mittels Diodenarray aufgenommen. Das Diodenarray besteht aus vielen, meist 1024 Photodioden, von denen jede permanent einen Wellenlängenbereich registriert. Der Wellenlängenbereich kann vom Anwender bestimmt werden.
Daraus ergibt sich ein dreidimensionales Chromatogramm.
Der Brechungsindex-Detektor (RI) wird für nicht UV-absorbierende Substanzen verwendet. Er misst den Unterschied des Brechungsindexes zwischen reinem Laufmittel und mit Probe vermischtem Laufmittel.
Verwendung findet er hauptsächlich in der Polymerchemie und in der Zuckeranalytik.
Im Elektrochemischen Detektor (ECD) werden durch Anlegen eines Potentials die Substatkomponenten oxidiert oder auch reduziert. Die Veränderung des Potentials zeigt das Vorhandensein einer Substanzkomponente an. Sein Einsatzgebiet ist hauptsächlich die klinische Chemie.
Viele Stoffklassen, wie z.B. Lipide, Kohlenhydrate, Polymere, Tenside, Aminosäuren, sind nicht oder nur in geringem Maße UV/VIS-aktiv.
Daher ist der Lichtstreu-Detektor (ELSD) in der HPLC und GPC sehr gut als Universaldetektor geeignet, da er ein physikalisch anderes Detektionsprinzip verwendet. Der Eluentenstrom wird mit Druckluft/Stickstoff vernebelt und in einer Trocknungseinheit aus Glas verdampft. In den daraus resultierenden Aerosolpartikeln werden die Analyten massenselektiv über Lichtstreuung gemessen.
Dieses Detektionsprinzip erlaubt im Gegensatz zum RI-Detektor und elektrochemischen Detektor (ECD) die Verwendung von Eluentengradienten.
Die Lichtstreutechnik ermöglicht höchste Sensitivität (Nachweisgrenze< 30 ng Glucose „on column) und driftfreie Detektion ohne umständliche Einstellungsprozeduren.
Die Vorteile eines Fluoreszenzdetektor liegen in seiner niedrigen Nachweisgrenze und seiner hohen Selektivität. Jedoch gibt es nur wenige Substanzen die mit diesem Detektor erfasst werden können.
Die Aufgabe eines Detektors besteht darin, die in der Trennsäule getrennten und in der
mobilen Phase stark verdünnten Probnemoleküle zu erkennen.
Der am häufigsten in der HPLC verwendete Detektor ist z.Zt. der UV/Vis-Detektor.
Hierbei wird UV-Licht (Deuterium- oder Quarzlampe) einer bestimmten Wellenlänge durch eine Flusszelle
gestrahlt und dahinter auf einer Photodiode aufgefangen und als elektrisches Signal an die HPLC-Software
ausgegeben. Dabei wird der Lichtstrahl über Spiegel durch die Messzelle und durch die Vergleichmesszelle
gelenkt. Da Eluent und Probe das Licht unterschiedlich absorbieren ergibt ein sich veränderndes elektrisches
Signal. Diese Änderungen werden als Peak in der HPLC-Software angezeigt. Das Chromatogramm setzt sich
aus diesen Peaks zusammen.
Immer stärker kommt der universelle Dioden-Array-Detector (DAD) oder auch Photo-Dioden-Array-Detector (PDA) genannt, zum Einsatz. Er arbeitet ebenfalls im UV/Vis-Bereich (Deuteriumlampe oder Quarzlampe), allerdings wird hier das Analysenlicht als gesamtes Spektrum mittels Diodenarray aufgenommen. Das Diodenarray besteht aus vielen, meist 1024 Photodioden, von denen jede permanent einen Wellenlängenbereich registriert. Der Wellenlängenbereich kann vom Anwender bestimmt werden.
Daraus ergibt sich ein dreidimensionales Chromatogramm.
Der Brechungsindex-Detektor (RI) wird für nicht UV-absorbierende Substanzen verwendet. Er misst den Unterschied des Brechungsindexes zwischen reinem Laufmittel und mit Probe vermischtem Laufmittel.
Verwendung findet er hauptsächlich in der Polymerchemie und in der Zuckeranalytik.
Im Elektrochemischen Detektor (ECD) werden durch Anlegen eines Potentials die Substatkomponenten oxidiert oder auch reduziert. Die Veränderung des Potentials zeigt das Vorhandensein einer Substanzkomponente an. Sein Einsatzgebiet ist hauptsächlich die klinische Chemie.
Viele Stoffklassen, wie z.B. Lipide, Kohlenhydrate, Polymere, Tenside, Aminosäuren, sind nicht oder nur in geringem Maße UV/VIS-aktiv.
Daher ist der Lichtstreu-Detektor (ELSD) in der HPLC und GPC sehr gut als Universaldetektor geeignet, da er ein physikalisch anderes Detektionsprinzip verwendet. Der Eluentenstrom wird mit Druckluft/Stickstoff vernebelt und in einer Trocknungseinheit aus Glas verdampft. In den daraus resultierenden Aerosolpartikeln werden die Analyten massenselektiv über Lichtstreuung gemessen.
Dieses Detektionsprinzip erlaubt im Gegensatz zum RI-Detektor und elektrochemischen Detektor (ECD) die Verwendung von Eluentengradienten.
Die Lichtstreutechnik ermöglicht höchste Sensitivität (Nachweisgrenze< 30 ng Glucose „on column) und driftfreie Detektion ohne umständliche Einstellungsprozeduren.
Die Vorteile eines Fluoreszenzdetektor liegen in seiner niedrigen Nachweisgrenze und seiner hohen Selektivität. Jedoch gibt es nur wenige Substanzen die mit diesem Detektor erfasst werden können.
Der Fraktionensammler
Damit Ihnen keine wertvolle Substanzfraktion nach erfolgreicher Trennung verloren geht, dafür sorgt ein Fraktionensammler. Neben tropfen- und volumenabhängigem Sammeln ist vor allem das Fraktionieren über Zeitabschnitte, Zeitfenster und/oder Peak-Erkennung sehr hilfreich.
Optionale Ventile sorgen für ein kontaminationsfreies Sammeln in die einzelnen Gefäße.
Verschiedenste Rackformate von Mikrotiterplatten bis Großvolumina erlauben meist einen weiten Einsatzbereich.
Oftmals können Programme gespeichert und über die HPLC-Software automatisch abgerufen werden.
Die Software ermöglicht über ein integriertes Sampletracking eine genaue Zuordnung Ihrer Fraktionen zu den, in den Chromatogrammen aufgezeichneten Sammelereignissen sowie die Dokumentation der Fraktionierungen.
Damit Ihnen keine wertvolle Substanzfraktion nach erfolgreicher Trennung verloren geht, dafür sorgt ein Fraktionensammler. Neben tropfen- und volumenabhängigem Sammeln ist vor allem das Fraktionieren über Zeitabschnitte, Zeitfenster und/oder Peak-Erkennung sehr hilfreich.
Optionale Ventile sorgen für ein kontaminationsfreies Sammeln in die einzelnen Gefäße.
Verschiedenste Rackformate von Mikrotiterplatten bis Großvolumina erlauben meist einen weiten Einsatzbereich.
Oftmals können Programme gespeichert und über die HPLC-Software automatisch abgerufen werden.
Die Software ermöglicht über ein integriertes Sampletracking eine genaue Zuordnung Ihrer Fraktionen zu den, in den Chromatogrammen aufgezeichneten Sammelereignissen sowie die Dokumentation der Fraktionierungen.
klein
groß
Die HPLC-Software
Zur Steuerung der Anlage und zur Auswertung der Messergebnisse wird meistens eine HPLC-Software auf einem Personal-Computer verwendet. Für die qualitative Analyse werden nur alle Peaks, welche in Ihrer Probe enthalten sind getrennt (Substanzfraktionen). Bei der quantitativen Analyse muss die genaue Konzentration oder Menge, der in der Probe vorhandenen Substanzen bekannt sein. Dann lässt sich die Auswertung über die Fläche der Peaks durchführen.
Zur Steuerung der Anlage und zur Auswertung der Messergebnisse wird meistens eine HPLC-Software auf einem Personal-Computer verwendet. Für die qualitative Analyse werden nur alle Peaks, welche in Ihrer Probe enthalten sind getrennt (Substanzfraktionen). Bei der quantitativen Analyse muss die genaue Konzentration oder Menge, der in der Probe vorhandenen Substanzen bekannt sein. Dann lässt sich die Auswertung über die Fläche der Peaks durchführen.
semipräparativ
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scale-up
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präparativ
präparativ
präparativ
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Produktion
Produktion
Produktion
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Countercurrent
Chromatographie
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Countercurrent
Chromatographie
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Chromatographie
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Autosampler
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Detektoren
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Fraktionensammler
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HPLC Pumpen
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Rotationsverdampfer
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Säulenpacker
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Glaswaren
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HPLC Säulen
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Säulenmaterial
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Werkzeuge
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Haftung
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HPLC Grundlagen
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Impressum
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