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Minimierung der Kosten in der präparativen Flüssig-Chromatographie

Die HPLC ist heutzutage eine der effektivsten Verfahren zur Aufreinigung von Substanzen in der Chromatographie. Insbesondere bei der Einsparung verschiedener Kosten, wie für Lösemittel oder Arbeitszeit, zeigt sich die Stärke der präparativen HPLC. In folgendem Artikel werden wichtige Einflussgrößen angesprochen, die zur Reduzierung von Kosten für die Isolierung und Aufreinigung von Substanzen führen können.


Der Säulenpackstand

Präparative HPLC Säulen mit einem Innendurchmesser von 25 mm und größer sind teuer, oft nur in bestimmten Längen erhältlich und die Trennleistung lässt aufgrund von Instabilitäten der Säulenpackung meist schnell nach.

Mit einem Säulenpackstand kann man diese Probleme durch selber packen von HPLC Säulen mit Säulenmaterial umgehen und Kieselgel oder Polymerphasen sind preisgünstig und leicht zu erhalten. Ein einfaches Rechenbeispiel verdeutlicht den nicht unerheblichen Kostenunterschied zwischen einer fertigen gekauften HPLC Säule und einer selber gepackten HPLC Säule im Säulenpackstand.

Das Säulenmaterial C18 (RP18) mit 10 µm Körnung und 100 Å kostet ca. 3.500 €/kg. Für eine HPLC Säule mit 50 mm Innendurchmesser benötigt man etwa 300 g bei 250 mm Bettlänge, d.h. die Kosten für eine 50 mm HPLC Säule im Säulenpackstand betragen 1050 € pro Packung. Der Kostenanteil für den Säulenpackstand beträgt 2.400 €/ Jahr (12.000 €/5 Jahre). Eine fertig gepackte HPLC Säule, C18 (RP18) 50x250, 10µm, 100 Å, von einem namhaften Säulenhersteller kostet 13.500 €.

Säulenpackstand

Bei einem Verbrauch von drei dieser HPLC Säulen pro Jahr ergibt sich folgender Vergleich. Die selber gepackte HPLC Säule im Säulenpackstand kostet somit 1.050 € x 3 = 3.150 € Säulenmaterial plus 2.400 € für den Säulenpackstand ergeben zusammen 5.550 €. Dem gegenüber stehen die Kosten von drei fertigen Säulen 13.500 € x 3 = 40.500 €.

Neben diesem Kostenvorteil gibt es noch weitere Vorzüge:

  • Man braucht nur die Bettlänge zu packen, die für die Trennung nötig ist, d.h. man spart Säulenmaterial und Lösemittel.
  • Ist die HPLC Säule verschmutzt oder verstopft, kann sie entpackt, das Säulenmaterial gereinigt und wieder neu gepackt werden.
  • Entpacken und Packen kann in weniger als einer Stunde erfolgen, d.h. Sie sparen sich das Warten auf die bestellte, fertig gepackte Säule.

Kostenminimierung

Kostendifferenz eines Jahresbedarfs an drei selber gepackten HPLC Säulen (SP) gegenüber drei fertig gekauften HPLC Säulen, C18 50x250, 10 µm, 100 Å.

Für denjenigen, der nur geringe Mengen Substanz aufreinigen möchte, müssen die Kosten des Systems im Verhältnis zur Stoffumsatzkapazität des Systems stehen. Allerdings kann ein ursprünglich sehr preisgünstiges System sehr teuer werden, wenn es schwierig zu bedienen ist und die Substanz nicht ausreichend aufgereinigt werden kann. Dann werden Lösemittelverbrauch und schnelle Verfügbarkeit des gereinigten Stoffes die dominanten Kostenfaktoren. Bei nicht genügend optimierten oder sehr schwierigen Trennungen sind bis zu 90% für Lösemittelkosten zu veranschlagen.

Verkürzung der Laufzeit von präparativen Trennungen

In der präparativen Flüssigchromatographie ist die Optimierung der Laufzeit das wesentliche Kriterium. In analytischen Trennungen ist es das Ziel, so viele Komponenten wie möglich aufzutrennen, woraus oft lange Laufzeiten und der Gebrauch langer Säulen resultiert. Bei präparativen Trennungen sollten die Laufzeiten wesentlich kürzer sein, da man nur bestimmte Probenkomponenten in möglichst kurzer Zeit trennen muss. Dabei wird die HPLC Säule so stark beladen, bis sich die zu isolierende Komponente mit Nachbarpeaks zu überlappen beginnt.

Für eine hohe Trennschärfe ist auch die Säuleneffizienz entscheidend, die vor allem von der Partikelgröße abhängt. Es ist daher sinnvoll, kurze HPLC Säulen mit Material der Körnung 5 oder 10 µm zu verwenden. Dadurch wird die Laufzeit kurz gehalten, was sich in hohem Stoffumsatz und geringerem Lösemittelverbrauch niederschlägt. Obwohl die Preise für kleinpartikuläre Säulenmaterialien größer als für 20 µm bis 100 µm Material sind, spart man bis zu 50%, vor allem an Lösemittelkosten, ein.

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Kleinere Säulenmaterialien haben außerdem den Vorteil, dass deren Effizienz bei hohen Flussraten gesteigert wird. Bei großen Partikeln müssen geringere Flussraten eingesetzt werden, dies bedeutet oft sehr lange Laufzeiten und es müssen längere Säulen verwendet werden, um die geringere Trennleistung der größeren Partikel zu kompensieren.

Für Aufreinigungen größerer Probenmengen lässt sich eine andere Strategie vorschlagen.
Anstelle einer Methodenoptimierung bis zur Basislinientrennung der interessierenden Komponente wird die HPLC Säule stark überladen. Dass reine Material wird gesammelt und unreine Fraktionen werden nochmals aufgereinigt. Mit dieser Methode wird ein 10 bis 100fach höherer Durchsatz erzielt, da durch die Überladung der Effekt der “Displacementchromatographie” erzielt wird. Die Peakbanden überlappen sich nicht mehr wie in der klassischen Chromatographie, in der Peaks die Form einer Gausskurve besitzen. Diese Banden besitzen über die gesamte Peakhöhe die gleiche Breite und sind nahezu voneinander getrennt. Dieser Effekt zeigt sich insbesondere bei kleinen Partikelgrößen, allerdings muss die optimale Beladung und der Anteil der reinen Fraktion empirisch ermittelt werden.

Gegen den Einsatz von kleinen Partikeln in der präparativen Säulenchromatographie sprachen früher die mangelnde Verfügbarkeit an gut gepackten HPLC Säulen und an HPLC Pumpen, die gegen hohe Gegendrücke fördern konnten. Durch Verwendung der dynamisch axialen Kompression beim Säulenpackstand und dem Einsatz von HPLC Pumpen für hohen Fluss bei hohem Gegendruck ist dies kein Problem mehr.

Gesteigerte Beladungskapazität

Der limitierende Faktor für die Beladung ist oft die Probenlöslichkeit in der mobilen Phase. Für viele synthetische Substanzen ist daher Reversed-Phase-Chromatographie nicht geeignet, da sich diese oft unpolaren Stoffe besser in Ethylacetat als in Wasser lösen. Daher führt der Wechsel zu Normalphasentrennungen meist zu wesentlich erhöhtem Durchsatz, weil sich die Probe um ein Vielfaches besser in Normalphasen Solventien löst.

Nur Proteine, Peptide und Biopolymere werden meist mit Reversed Phase, Ionenaustausch oder anderen Techniken getrennt. Allerdings müssen solche Proben eher verdünnt aufgegeben werden, um ein Ausfallen der Substanzen auf der Säule zu vermeiden. Entscheidend ist oft der Puffertyp und pH-Wert, so besitzen z.B. Proteine ihre höchste Löslichkeit in einer pH-Einheit unter bzw. über dem isoelektrischen Punkt. Es werden meist Puffer, wie Trifluoressigsäure (TFA), Ammoniumformiat, Triethylammoniumacetat (TEAA) und Ammoniumacetat eingesetzt, da diese durch Lyophilisation entfernt werden können und keine Entsalzung notwendig ist.

Professor Question

Um das Ausfallen auf der HPLC Säule zu vermeiden ist es aber auch wichtig, die Probe hinsichtlich ihrer Löslichkeit in den Solventien zu testen. Eine einfache Methode kann dabei behilflich sein:
Skalieren Sie die präparative Trennmethode linear auf einer analytischen Säule mit 4,6 mm Innendurchmesser herunter und injizieren Sie eine kleine Probenmenge. Notieren Sie sich die Peakflächen und steigern Sie das Injektionsvolumen um den Faktor 10 usw. Ist die Peakfläche wesentlich geringer als der x-fache Wert, deutet das auf ein Ausfallen auf der Säule hin. Auch auf die Wahl der Lösungsmittel sollte ein Augenmerk gelegt werden. Halogenierte Solventien sind teuer und toxisch. Methanol oder Ethanol sind gegenüber Acetonitril hinsichtlich Kosten und Sicherheit zu bevorzugen. Lösungsmittelrecycling durch Destillation oder durch Verwendung isokratischer Methoden sollte auch in die Überlegungen miteinbezogen werden.

Reinheit der Probe

Die Beschaffenheit der Probe vor der Aufreinigung wirkt sich ebenso in den Kosten aus. Eine Probe, die z.B. nur 5 % des benötigten Produktes enthält, erfordert die 10fache Zahl an Injektionen, als eine Probe, die 50 % enthält. Daher sollte man Vorreinigungsschritte, wie Umkristallisation, Flashchromatographie, Festphasen- oder Flüssig-Flüssig Chromatographie einsetzen. So kostet eine präparative Festphasenextraktionskartusche weniger als 100 € und kann durch Anreicherung der Zielkomponente tausende Euro sparen. HPLC ist erst dann eine ökonomische Aufreinigungsmethode, wenn Sie dazu eingesetzt wird, Stoffe mit 80 bis 99 % Reinheitsgrad aufzureinigen.

Trennmethode

Zum Beispiel kann die Trennung der Substanzen durch Flüssig-Flüssig Extraktion erfolgen, auch Verteilungs-chromatographie genannt, hierbei erfolgt die Trennung von Proben nach Polarität der Inhaltsstoffe in einem kontinuierlichen Prozess zwischen zwei, nicht miteinander mischbaren flüssigen Phasen.

Für diese Trennmethode wird der SCPC verwendet, in diesem befindet sich ein Rotor der aus vielen runden Metallplatten besteht, in denen über tausend kleine Kammern über Kanäle miteinander verbunden sind. Im Rotor wird die flüssige stationäre Phase von einer mobilen flüssigen Phase durchströmt. Die Zentrifugalkraft bewirkt nun im Rotor die Trennung der beiden flüssigen Phasen in den einzelnen Kammern. Liegt die flüssige mobile Phase im Gleichgewicht (Equilibrium) mit der flüssigen stationären Phase vor, kann die Probe in den Rotor injiziert werden.

SCPC

SCPC

Rotor

Rotor

Rotorkammer

Rotorkammer

Mad Professor

Nun findet der Trennprozess in den beiden, nicht miteinander mischbaren Phasen statt, wobei sich die Inhaltsstoffe der Proben gemäß ihrer Verteilungskoeffizienten KD in diesen beiden flüssigen Phasen verteilen und mit verschiedener Geschwindigkeit durch die Kammern zum Rotorausgang bewegen, um fraktioniert zu werden. Diese inovative Technik erlaubt Stoffgemisch Trennungen von Multigramm bis Kilogramm, selbst von sehr problematischen Trennaufgaben.

Die Verteilungschromatographie des SCPC garantiert eine 100%ige Wiederfindung der Probe. Das ergibt sich aus der Fraktionierung der flüssigen mobilen und der flüssigen stationären Phase, in denen alle Inhaltsstoffe enthalten sind. Diese Eigenschaften ermöglichen es dem Anwender schnell, unproblematisch und kostengünstig Proben verschiedenster Matrices aufzureinigen.

Der SCPC beschleunigt in Kombination mit den Komponenten der HPLC den gesamten chromatographischen Prozess bis hin zum reinen Produkt. Dabei kann das Upscaling vom analytischen Arbeiten bis hin zur Produktion durchgeführt werden, da die Trennergebnisse bei allen Rotorgrößen identisch sind und sich die Probenmengen um den Volumenfaktor upscalen lassen.

Auf Grund der flüssigen Phasen müssen die Flussraten nicht hochskaliert werden. In Summe sinken die Kosten für präparative Trennungen im Vergleich zur reinen HPLC mit Festphasensäule bis um den Faktor 10.

HPLC in Kombination mit Festphasen-Säule und SCPC als rotierende Säule mit Flüssig-Flüssig Chromatographie.
Hier wird der SCPC zur Vorreinigung verwendet und die Substanz danach über die Festphasen-Säule zur Feinreinigung geschickt. Diese Methode eignet sich besonders für Trennaufgaben welche mit der HPLC und Festphasen-Säule nur ungenügend oder überhaupt nicht zu realisieren sind.

HPLC System mit SCPC

HPLC mit Festphasen-Säule und SCPC mit Flüssig-Flüssig Trennsäule

Fazit

Zusammenfassend ist zu sagen, dass viele Faktoren die Kosten für eine präparative Aufreinigung beeinflussen. Es muss also zwischen den verschiedenen Einflussgrößen abgewogen werden, so kann z.B. die Kosteneinsparung durch eine gesteigerte Substanzlöslichkeit in einem bestimmten Solvens durch dessen Beschaffungskosten hinfällig werden. Die beste Methode ist es, die präparative Trennung auf einer analytischen Säule zu modellieren und auf dieser Grundlage alle Kostenfaktoren aufzulisten.

In dieser Hinsicht zeigt sich der Vorteil des Säulenpackstandes und des SCPC vor allem darin, dass man mit einer großen Zahl verschiedener Trennphasen und unter verschiedenen Bedingungen arbeiten kann. Es ist damit besser möglich, kostengünstige Methoden auf der analytischen Skala zu entwickeln und dann ganz einfach linear auf die präparative Skala zu übertragen.