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Flüssig-Flüssig Extraktion

auch Verteilungschromatographie oder Flüssig-Flüssig Chromatographie genannt.

Oft ist die Auftrennung von Substanzgemischen durch schlechte Löslichkeit der Proben, Zusammensetzung der Inhaltsstoffe und deren große Polaritätsunterschiede sehr erschwert. Basierend auf der Fest-Flüssig Extraktion haben die klassischen chromatographischen Methoden wie HPLC, MPLC, Flash, bei komplexen Gemischen, wie Naturstoffextrakten und Syntheseprodukten, erhebliche Nachteile. Neben der zeitaufwendigen und kostenintensiven Aufarbeitung eines solchen Gemisches ist das Upscalen erarbeiteter Methoden nicht selbstverständlich. Hier bietet die Flüssig-Flüssig Extraktion erhebliche Vorteile. Aufgrund ihrer flüssigen stationären Phase werden die Inhaltsstoffe nur nach Polarität, d.h. nach ihrem Verteilungskoeffizienten KD getrennt. In der Praxis wird die Verteilungschromatographie mit dem SCPC realisiert.


Key Features

  • Keine irreversible Adsorption von Probenbestandteilen an einem festen Träger und damit 100%ige Wiederfindung der Probeninhaltsstoffe.
  • Keine oder nur geringe Probenvorbereitung.
  • Fraktionierung der mobilen Phase und flüssigen stationären Phase.
  • Hohe Beladbarkeit und damit direktes Upscaling von Milligramm bis in den Kilogrammbereich.
  • Keine Begrenzung der Löslichkeit der Probe durch große Volumen an Solvens und Lösung in polarer und apolarer Phase.
  • Wechsel von mobiler zu stationärer Phase während des Chromatographie Laufes.
  • Große Einsparung an Zeit und Lösemittel.

Die kontinuierliche Verteilung

Eine kontinuierliche Verteilung in der Flüssig-Flüssig Extraktion erhält man durch die serielle Verbindung einzelner Trennstufen, genannt Kammern. Sind alle Kammern mit beiden Phasen eines 2-Phasengemisches, z.B. n-BuOH/H20 gefüllt, wird eine dieser Phasen (mobile Phase) durch das Kammernsystem gefördert. Die andere Phase (stationäre Phase) wird durch Zentrifugalkraft im Kammernsystem retendiert und es kann somit ohne festes Säulenmaterial chromatographisch gearbeitet werden. Analog zur statischen Verteilung erhält man hier für K=CSP/CMP mit CSP als Konzentration eines Stoffes in der stationären Phase und CMP als Konzentration des gleichen Stoffes in der mobilen Phase.


Der SCPC

Die Trenneinheit des SCPCs ist der Rotor, mit einem Trennsystem aus untereinander verbundenen Kammern. Nach Befüllen des Rotors mit der flüssigen stationären Phase und Beginn der Rotation wird die mobile Phase durch den sich drehenden Rotor gepumpt. Die mobile Phase verdrängt einen Teil der stationären Phase und nach Einstellung des Gleichgewichts kann die Probenaufgabe erfolgen.

Während des chromatographischen Laufes treten so die einzelnen Fraktionen am Ende des Kammersystems zeitlich verschieden gemäß ihres Verteilungskoeffizienten K aus dem Rotor aus. Die hohe Auflösung der Probeninhaltsstoffe wird bei dem SCPC durch die große Anzahl Kammern und durch einen guten Massentransfer zwischen beiden Phasen erreicht.

In dem Rotor dienen die, in Serie angeordneten Rotorkammern, als hydrostatisch arbeitende chromatographische Säule (Scheidetrichterprinzip). Nach Durchlaufen der Probe von über 1000 Kammern, mit nicht miteinander mischbaren Phasen, treten die Inhaltsstoffe getrennt aus dem Rotor aus.

SCPC

SCPC

SCPC Rotor

Rotor

SCPC Rotorkammer

Rotorkammern

SCPC Rotorkammerverteilung

Verteilung in den Kammern


Einfache Substanzisolierung

Klassische chromatographische Trennverfahren wie HPLC, MPLC, Flash, etc. arbeiten mit festem Säulenmaterial als Trennmedium. Dadurch sind Naturstoffextrakte aus Pflanzen, Boden und Pilzen schwierig chromatographisch aufzutrennen, da zum einen Matrixeffekte, hervorgerufen durch Chlorophylle, Huminsäuren, Schleimstoffe etc., auftreten und zum anderen die Lebensdauer von Trennsäulen verringert wird.

Hier nimmt die Probenvorbereitung einen wichtigen Teil des gesamten Aufarbeitungsprozesses ein. Ähnliches gilt für organische Synthesen und die Abtrennung seiner Nebenprodukte vom Zielprodukt. Die Verteilungschromatographie erlaubt im Gegensatz dazu eine problemlose und schnelle Bearbeitung solcher Proben. Aufgrund des flüssigen 2-Phasensystems kann eine Probenvorbereitung meist entfallen und ist nur auf Verdünnungsschritte der Probe begrenzt.

Mittels Verteilungschromatographie arbeitet der SCPC absolut verlustfrei, da irreversible Adsorptionen von Probenbestandteilen aufgrund fehlender Festphase unmöglich sind. Die üblichen Matrixeffekte stören eben so wenig, wie schlechte Löslichkeit der Probe, da die Probe in beiden Phasen gelöst injiziert werden kann. Dies ist vor allem bei Probeninhaltsstoffen unterschiedlichster Polarität günstig.

Auf Grund des technisch einfachen Verfahrens der Flüssig-Flüssig Extraktion lassen sich schnell und effizient komplexe Substanzgemische trennen. Die Anwendungen reichen von Antibiotika, Steroiden, Peptiden, Proteinen bis hin zu Phenolen, Polyphenolen, Terpenen, Glykosiden, Saponinen, Flavonoiden, Alkaloiden, Pflanzenhormonen, Insektizide, Herbizide, Fettsäuren und Zuckern. Spezielle Phasengemische erlauben sogar die Auftrennung von Metallen, Isomeren und chiralen Proben. Neben dem Trennen von Inhaltsstoffen ist die Verteilungschromatographie für die Anreicherung von Kleinstmengen ideal geeignet. Als Beispiel seien hier Tensidbestimmung aus Oberflächengewässern und Schadstoffbestimmung in Böden genannt. Durch die Möglichkeit des Linearen Upscalings lassen sich sogar Trennungen bis in den Kilogrammbereich leicht durchführen.

Dabei ist die Flussrate unabhängig von der Probenmenge und nur abhängig vom Rotorvolumen und entspricht ca. nur 1/10 der Flussrate, die für die Aufreinigung einer vergleichbaren Probenmenge mittels HPLC benötigt wird. Dies spart immens Lösungsmittel beim präparativen Chromatographieren und senkt damit die Kosten, zumal dabei Lösungsmittel minderer Qualität verwendet werden können.

Die folgenden Applikationsbeispiele zeigen einige praxisorientierte Anwendung der Flüssig-Flüssig Extraktion. In den 1940er Jahren des letzten Jahrhunderts von Dr. Craig entwickelt, hat diese sich zu einer, neben anderen Chromatographie Verfahren, gleichberechtigten Trenntechnik weiterentwickelt.


Applikationsbeispiel 1

Isolierung von 10-deacetylbaccatin III (10-DAB) aus den Nadeln der Pflanze Taxus Chinensis.

HPLC-Chromatogramm mit SCPC 1

[Abb. 1] HPLC-Chromatogramm des Rohextraktes von Taxus chinensis.

HPLC-Chromatogramm mit SCPC 2

[Abb. 2] HPLC-Chromatogramm der 10-DAB Fraktion und SCPC-Chromatogramm des Rohextraktes von Taxus Chinensis mit 10-DAB Peak. Probenmenge 1000 mg Rohextrakt; Lösungsmittelsystem: n-Hexan/Chloroform/MeOH/Wasser; SCPC mit 200 ml Rotor.

Das Verfahren zeigt eine schnelle semipräparative Aufreinigung der Zielfraktion 10-DAB aus dem Rohextrakt mit anschließender HPLC Analyse der Zielfraktion. Bei fast gleicher Chromatographie Zeit werden bei der Flüssig Flüssig Extraktion mit dem SCPC nur insgesamt ca. 1 Liter Lösungsmittel der Qualität p.a. verwendet. Bei der HPLC hingegen, müsste mit einer 5 cm ID Säule gefahren werden und man würde ca. 4 Liter Lösungsmittel der HPLC-Qualität verbrauchen. Bei der Flüssig Flüssig Extraktion konnte der Rohextrakt direkt ohne Probenvorbereitung aufgegeben werden. Unter Einbeziehung aller Kosten verursachenden Faktoren, liegt der SCPC bei nur 15-20 % der HPLC Kosten.


Applikationsbeispiel 2

Isolierung einer Zielsubstanz aus dem Wurzelextrakt einer südafrikanischen Pflanze.

HPLC-Chromatogramm mit SCPC 3

[Abb. 3] Bezeichnend für Naturstoffe zeigt das analytische HPLC Chromatogramm des Rohextraktes eine Vielzahl von unbekannten Substanzen (Peaks). Eine Methodenentwicklung zur Isolierung der Zielsubstanz (Pfeil) auf Basis der analytischen Daten ist sehr zeitaufwendig. Die Zielsubstanz liegt in nur wenigen Prozenten vor. Es empfiehlt sich die Aufreinigung mittels SCPC.

HPLC-Chromatogramm mit SCPC 4

[Abb. 4] HPLC Chromatogramm des angereicherten Extraktes mit Zielsubstanz (Pfeil). Um eine effiziente Isolierung und Gewinnung der Zielsubstanz zu erreichen, wurde die Zielsubstanz des Wurzelextraktes durch einen einmaligen Extraktionsschritt auf über 20% angereichert.

HPLC-Chromatogramm mit SCPC 5

[Abb. 5 links] Der angereicherte Extrakt, Peak 3, nach Auftrennung mittels SCPC in typischen Peakformen der Flüssig-Flüssig Extraktion.
[Abb. 5 rechts] HPLC-Chromatogramm der Zielfraktion Peak 3 mit 98% Reinheit.


Lösungsmittelsystem: Heptan/Ethylacetat/Ethanol/Wasser. 2 Tage Methodenentwicklung für die Verteilungschromatographie.


Applikationsbeispiel 3

Für die Auftrennung von chiralen Substanzen im präparativen Maßstab hat sich die Flüssig Flüssig Extraktion als kostengünstige Alternative zur HPLC bewährt. Aus einer Vielzahl von chiralen Selektoren kommen allerdings nur vier zum praktischen Einsatz, ein Beispiel sei hier erwähnt.

HPLC-Chromatogramm mit SCPC 6

[Abb. 6] Trennung von 4 DNB-Aminosäure Racematen mittels SCPC. N-Dodecanoyl-L-proline-3,5-dimethylanilin als chiraler Selektor. Lösungsmittelsystem: Hexan/EE/MeOH/10mM HCL, Substanzmenge 10 mg je DNB – Aminosäure [10]. Die Chromatogramme zeigen die Aminosäureprobe mit und ohne chiralem Selector.

Eine sehr effektive Methode zur Trennung polarer Substanzen ist das pH-Zone Refining. Hierbei wird duch Zugabe von z.B. TFA zur organischen Phase und Zugabe von z.B. NH3 zur wässrigen Phase ein pH-Gradient erzeugt, der durch die verschiedenen pKs-Werte der Substanzen zu einer Trennung der polaren Substanzen führt, die scharfe Trenngrenzen der Probeninhaltsstoffe aufweist.

HPLC-Chromatogramm mit SCPC 7

[Abb. 7]

Das Chromatogramm zeigt eine Trennung von 8 Aminosäuren. Das pH-Zone-Refining ist genau auf die Trennung von polaren Substanzen zugeschnitten. Da die mobile Phase sich mit der stationären Phase während der gesamten Chromatographie Zeit austauscht, erstreckt sich der pH Gradient über die gesamte Länge des Rotors.

Lösungsmittelsystem: MTBE/ACN/H2O, Substanzmengen 100 mg je Peptid


Fazit

Die Flüssig Flüssig Extraktion ist durch die technische Realisierung der kontinuierlichen Verteilung zu einer kostengünstigen, schnellen und vor allem flexiblen Methode zur Trennung selbst schwierigster Proben geworden.

Die Flexibilität begründet sich dabei auf einer Vielzahl an möglichen Lösemittelsystemen, der Vorteile der flüssigen stationären Phase, sowie einfacher Behandlung von Proben mit schwierigen Matrixeffekten. Der SCPC alleine oder auch in Kombination mit der HPLC führt zu einer Beschleunigung bei der Aufreinigung von Rohextrakten und Syntheseprodukten und das bis zum 10fachen verglichen mit rein HPLC basierten Trennverfahren. Ein weiterer Vorteil der Verteilungschromatographie ist das direkte Upscalen von Flüssig Flüssig Extraktions Methoden bis in den Kilogrammbereich. Diese Form der schnellen Substanzgewinnung ist für weiterführende Methoden wie z.B. Metabolitenbestimmung, Strukturaufklärung, etc. von großem Vorteil. Die Fülle an weltweit veröffentlichten Arbeiten zeigt, dass die Verteilungschromatographie im Begriff ist neben der HPLC und DC zu einer Standardmethode in der Chemie, pharmazeutischen Chemie, pharmazeutischen Biologie, chemischen Ökologie und anderen Fachbereichen zu werden.


Historie der Verteilungschromatographie, auch Flüssig-Flüssig Extraktion genannt

Die Suche nach den Bestandteilen von materiellen Dingen, sowie deren Zerlegung und Trennung von Materialien war zu jeder Zeit eine Herausforderung für die Menschheit.


Scheidetrichter

Scheidetrichter

So wird bis heute der traditionelle Weg der Extraktion von Substanzen aus Pflanzen, Erde oder Nahrungsmitteln mit Hilfe von Wasser in einem Scheidetrichter (ST) durchgeführt. Verbessert wurde diese Verfahrensweise durch die Zugabe von nicht wassermischbaren Lösemitteln, wodurch man ein flüssiges 2-Phasen System erhielt.

Brachte man jetzt eine Probe in dieses System, dann verteilten sich die verschiedenen Inhaltsstoffe der Probe in beiden Phasen. Damit hatte der erste Schritt einer Auftrennung von Substanzen oder Verbindungen stattgefunden.

Craig-Prinzip

Craig-Prinzip

Im Jahre 1940 verbesserte der Wissenschaftler Dr. Craig durch in Serie verbundene Glasgefäße die Trenneffizienz. Diese sogenannten Craig-Anlagen werden heute noch manchmal zur Aufreinigung von Peptiden verwendet. Der Nachteil dieser Anlagen ist der große Lösungsmittelverbrauch und die extremen Ausmaße der Anlage.

DCCC

DCCC

Um Anlagengröße und Lösungsmittelverbrauch zu reduzieren, wurden in den Jahren 1960 bis 1980 verschiedene Geräte in den Markt gebracht, die auf der CCC-Trenntechnologie (Counter Current Chromatography) basieren. Hierbei nutzte man den physikalischen Effekt, die Inhaltsstoffe einer Probe aufgrund ihrer Polaritätsunterschiede in einem 2-phasigen Lösungsmittelsystem

RLCCC

RLCCC

Ein erster Geräteversuch nach Craig war der DCCC (Droplet Counter Current Chromatograph), mit langen Trennzeiten, geringem Probendurchsatz und Leckage Problemen. Das gleiche Schicksal geringer Akzeptanz im Markt ereilte den RLCCC (Rotary Locular Counter Current Chromatograph). Wegen ständigen Leckage Problemen, langen Füllzeiten und Limitierungen in der Aufgabe der Probenmengen, verschwand auch der RLCCC schnell wieder vom Markt.

HSCCC

HSCCC

Bessere Trennungen und akzeptable Chomatographie Zeiten erlaubte der, Ende der 80er Jahre eingeführte HSCCC (High Speed Coil Counter Current Chromatograph) mittels Flüssig-Flüssig Extraktion. Aufgrund seiner technischen Ausführung, der planetaren Aufhängung, konnten jedoch nur kleine Probenmengen von 2 bis 3 g in einem Lauf getrennt werden.

LSCCC

LSCCC

Ein erster Ansatz die CCC-Technologie industriell einzusetzen, wurde 1991 mit der Einführung des LSCCC (Low Speed Coil Counter Current Chromatograph) versucht. Doch auch hier kam das Aus nach wenigen Jahren aufgrund des Missverhältnisses von großem Platzbedarf und hohem Gewicht von 300 kg bei nur 12-15 g Probenmenge je Lauf. Wie schon bei dem HSCCC war auch bei dem LSCCC die planetare Aufhängung das größte Hindernis ein Upscaling, sowie akzeptable industrielle Trennzeiten zu erreichen.

SCPC

SCPC

Der Durchbruch in der Flüssig-Flüssig Extraktion gelang in 1997 mit Entwicklung des SCPCen, denn der SCPC bietet sehr schnelle Aufreinigung bei sehr großer Probenmenge. Bei dieser optimierten Trenntechnik dienen nicht mehr Glasgefäße, sondern über tausend miteinander verbundene Kammern in Metallscheiben als Trennorte. Viele dieser übereinander angeordneten Metallscheiben ergeben einen Rotor dessen Drehzahl im SCPC elektronisch gesteuert wird. Die gewünschten Trennungen vollziehen sich in den Rotorkammern mittels Fliehkraft in der flüssigen stationären Phase und in der flüssigen mobilen Phase.

In der Praxis wird der SCPC an der HPLC anstatt der HPLC Säule mit festem Träger verwendet, quasi als rotierende Säule. Aber auch die Kombination von beidem ist z. Bsp. für viele Aufreinigungen von problematischen Substanzen bestens geeignet. So kann als Vorstufe der Aufreinigung der SCPC verwendet werden und danach im gleichen Lauf die vorgereinigte Substanz über die HPLC Festphasen-Säule zur Feinreinigung geschickt werden.

Diese Methode hat den großen Vorteil, dass die Festphasen-Säule nicht so schnell verschmutzt und ersetzt werden muss, außerdem kann viel Lösemittel eingespart werden. Durch seine Vielseitigkeit, Schnelligkeit und viele weitere Vorteile findet der SCPC immer häufiger Anwendung in den Bereichen Forschung, Entwicklung und Produktion.